银丰生命延续计划
YINFENG LIFE EXTENSION PROGRAM
新突破！皮肤低温保存新探索，助力低温研究新进展
发布时间：
2023-08-18 15:37
来源：
人体是由细胞以及复杂组织器官组成的有机生命体。当机体内组织器官出现损伤或丧失原有功能时，组织器官移植术可以将自体或其他个体组织器官的一部分植入代替损伤或失去功能的部分。当前，组织和器官移植术与相关基础研究的快速发展对复杂组织器官的高质量保存提出了迫切需求。供体组织器官的缺乏以及供体和受体在实践和空间上的不匹配限制了其在临床上的应用，超低温保存有望解决这一限制。
探索复杂组织器官长期高质量冷冻保存已成为国际上新的研究热点。一般认为，在深低温（≤-130℃）下进行组织和器官冷冻保存可能实现长期的储存，或许可以有效解决大量适合移植的器官被丢弃的问题。但是，冻存或复苏过程会对生物样本造成较大损伤，冷冻保护剂作为生物样本在低温状态下的保护介质，作用尤为重要。
冷冻保护剂
低温/深低温保存不可或缺的保护介质
冷冻保护剂是细胞、组织、器官低温/深低温保存中减少冷冻损伤不可或缺的成分。自1949年英国生物学家C.Polge和A.U.Smith发现添加了甘油的精子可以经历低温仍然存活（Nature，1949）以来，越来越多的不同类型的冷冻保护剂被应用于生物样本的低温和深低温保存中。
冷冻保护剂可根据在深低温保存中的作用分为两大类：渗透性和非渗透性保护剂。渗透性保护剂以多元醇类为主，包括乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇、丙三醇、甲酰胺和乙酰胺等。渗透性保护剂的作用是通过降低冰点，取代细胞内蛋白、DNA和其他成分周围的水分，减少或避免细胞内冰晶形成。非渗透性保护剂主要包括低分子量的单糖（果糖、葡萄糖、麦芽糖等）、双糖（蔗糖、海藻糖等）、多糖类（棉子糖等）以及分子量大于1000Da的高分子化合物(聚蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇和羟乙基淀粉等)。非渗透性保护剂有利于改善保护液的玻璃化性质，提高冷冻保护效果，同时通过渗透作用促使细胞脱水，稳定细胞膜，降低达到玻璃化本身所需要的冷冻保护剂的用量，从而减少玻璃化溶液的毒性。我们通过对不同组织和器官的保存效果探索有效的冷冻保护剂以及更合理的保存方法。
皮肤深低温保存，临床治疗新技术
皮肤是人体最大的器官，是人体内外环境的分界，也是人体表面的重要屏障，对人体的生理功能有重要的保护作用。对于因严重烧伤、外伤或皮肤疾病而使皮肤大面积缺损时，必须通过皮肤移植术修补缺损部位。因此，患者离体皮肤的保存是有必要的，使患者在身体条件允许时进行皮肤回植，可有效减少感染发生率，提高组织利用率，减轻患者经济负担，并有效改善患者的预后。目前，低温保存皮肤延迟移植已成为烧伤创面的基本治疗方法之一。
山东银丰生命科学研究院早在2016年就与山东大学齐鲁医院手足外科开展离体皮肤深低温保存方面的探索，对皮肤的分离处理、冷冻保护以及复温分析和临床回植进行了有效的实践，截止到2023年7月，已成功为84位患者进行了离体皮肤的深低温保存，成功回植56例，取得了良好的移植效果，并逐步建立起临床离体皮肤深低温保存的标准流程。
低温医学研究中心针对数十例动物皮肤，遴选一种含有麦芽糖糊精和尿素为原料的皮肤深低温冷冻保护体系，皮肤样本复苏后仍具有80%以上的活力，较常规冷冻保护剂有更高的保护活性，筛选琥珀酸脱氢酶法作为皮肤活力测定方法，于2021年获得国家发明专利一项（专利号201810076409.X）。
目前以皮肤为代表的组织在深低温保存等方面仍面临保护效果不佳、技术体系不完善等诸多问题，亟需进行改进，为了更好的筛选皮肤深低温冷冻保护剂以及降复温程序，提高皮肤组织的冻存效果，山东银丰生命科学研究院低温医学研究中心近期设计并开展了一系列涉及皮肤组织深低温保存关键技术的实验研究。
研究不辍，为皮肤低温保存树佐证
在常规应用的冷冻保护剂的基础上，通过文献调研、专家咨询以及细胞学验证等，遴选了以DMSO（二甲基亚砜）、海藻糖等主要成分的冷冻保护剂，通过多种渗透性和非渗透性的冷冻保护成分的联合使用，按照不同配比进行多次实验，筛选出保存效果更好的冷冻保护剂成分。
对不同冷冻保护剂进行差示扫描量热法（DSC）检测，根据DSC结果，研究程序化降温的相关设定，以不同冷冻保护剂的低温保护对人源化皮肤进行冻存验证。
利用金属套管和磁热复温技术开展人源皮肤深低温保存，通过磁热复温后进行HE染色、TUNEL凋亡检测、CD86抗原性检测，成功筛选以DMSO 、海藻糖、HES联合应用，辅以磁热复温技术的冷冻保护体系。
因捐献的离体人源皮肤数量较少且其因自身原因和操作、运输过程中对其有不同程度影响难以进行更深入的探究。实验团队设计了小型猪皮肤组织深低温保存移植实验。选取实验用巴马香猪背部皮肤，通过应用不同冷冻保护剂以及不同的冻存时间对猪皮肤移植到裸鼠后进行相关活性检测，验证了3种不同的冷冻保护液和分别深低温保存1周、2周和4周的保存效果。经过验证，所筛选的冷冻保护液（见下图冷冻保护剂A）相比于其他成分保护效果较好。
图：皮肤在不同冷冻保护剂和不同冻存时间中细胞存活率
通过项目组对动物皮肤低温保存和复温后移植等的探索，为离体人源皮肤的深低温保存优化和改进提供了良好的佐证，相信在不久的将来，采用新的皮肤深低温保护液和更加经济有效的保护方法，能够大大提升深低温保存皮肤的活率，为临床和患者提供更好的治疗选择。
YF系列低温保护体系，助力低温医学技术转化
低温保存，尤其是深低温保存，已经成为生物样本高质量保存的最佳方式。近年来，山东银丰生命科学研究院低温医学研究团队对细胞、组织、器官开展持续的低温冻存研究，形成冷冻保护剂及加载、洗脱，磁热复温等方面技术研究中英文论文近10篇。
低温医学研究中心在细胞、组织和器官低温保存研究的基础上，结合国内外文献资料和最新技术成果，针对不同类型的细胞、组织、器官、整体形成了30余种冷冻保护液，建立起了YF系列低温/深低温保护体系，为不同类型的生物样本提供冷冻保护液筛选、降温/复温技术指导，为细胞、组织、器官的深低温保存和人类的生命健康提供高质量的服务和支持。
冷冻保护剂图片
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