Nat Med | 将转基因猪心脏移植到活体人体内

研究概述

2025年1月8日，马里兰大学医学院Muhammad M. Mohiuddin教授在Nature Medicine期刊发表标题为“Transplantation of a genetically modified porcine heart into a live human”的研究论文，该研究主要进行了第二次将10基因编辑（10-gene-edited）的猪心脏移植入一名58岁终末期心力衰竭患者的临床试验。

通过更严格的供体筛查和选择更健康的受体，研究团队希望改善移植结果。移植后，心脏初期功能良好，但随后出现了快速进展的舒张性心力衰竭等问题。最终，患者在移植后40天选择转为舒缓治疗。该研究进一步探讨了异种移植领域面临的挑战和未来改进方向，特别是在基因编辑技术和免疫抑制策略方面。

导读

在首次基因改造猪-人心脏异种移植后的21个月，本研究的作者们决定于2023年9月20日进行第二次手术。这一决定是基于对首例患者60天生存情况的长期评估。

作者们认识到，基因改造的猪心脏是人类心脏的良好生理替代品，并且之前的猪巨细胞病毒（PCMV）筛查方案不足以检测潜伏病毒。此外，首例患者术前的虚弱状态和全血细胞减少症限制了从成功的非人灵长类动物（NHP）研究转化而来的首选免疫抑制和预防性抗病毒方案的全剂量使用。最终，作者们无法明确确定PCMV和排斥反应对异种移植物失败的贡献。在第二次案例中，他们希望避免这些干扰因素。他们采用了更敏感的筛查策略来检测供体动物中的PCMV，并选择了具有足够生理储备以耐受治疗的患者。

研究结果

1. 患者特征
该患者是一位58岁的男性，因缺血性心肌病导致心力衰竭恶化，此前曾接受过三支血管冠状动脉旁路手术，射血分数（EF）为15%。由于严重的周围和中枢动脉粥样硬化性血管疾病，需要多次经皮介入治疗，这限制了他接受标准心脏移植和机械循环支持的资格。此外，由于最近一次严重的胃肠道出血，他的病例被多家中心拒绝进行心脏移植和长期机械循环支持。在被提出进行实验性异种移植后，患者最初选择继续药物治疗，直到他无法再进行日常活动并感觉到自己即将死亡。他的病情恶化后，于8月中旬接受了异种移植的考虑。患者的血清抗猪抗体（APA）水平被认为是可以接受的低水平，筛查的IgG明显低于首例患者（图1）。

图1. 免疫控制评估。

在FDA审查期间，患者因病情恶化被迫住院。获得FDA批准后，患者同意入院，并很快获得了机构审查委员会、医疗中心和医学院的批准。在获得SPIND批准后，患者接受了抗CD40配体单克隆抗体Tegoprubart的治疗。

患者的同意过程由马里兰大学医学中心的临床伦理委员会和机构审查委员会监督，并对其能力进行了全面的精神病学审查。他有强大的社会支持，出色的医科学素养，并认识到自己需要进行实验性移植。术前优化导致了12升的负液体平衡和肾功能的改善。在移植前约12小时，患者出现了心室性心动过速，随后发展为心室颤动，需要短暂的心肺复苏和电击。尽管如此，患者仍然表现出继续进行手术的强烈愿望。移植团队和重症监护室医生评估后认为，患者的状况适合进行提议的实验性移植，且比之前的患者状况更好，因此决定继续进行异种移植。

2. 围手术期及术后早期病程

在移植当天，患者在再次开胸手术期间再次出现心室性心动过速。通过预先放置的右腋动脉和右股静脉通路启动了体外循环。电击复律至正常窦性心律后，完成了胸骨切开术，放置了上腔静脉插管并进行了心脏切除术。猪心脏在异种移植实验室手术室获取。根据之前患者成功的心脏尺寸匹配，这只18个月大的猪重114公斤，超过了受体82公斤的干体重，提供了273克的供体心脏。Revivicor提供的术前经食管超声心动图（TEE）测量的左心室（LV）质量表明心脏尺寸合适。在获取过程中计算的每搏输出量为可接受的最低值58立方厘米。猪心脏接受了XVIVO心脏灌注系统（XVIVO灌注）的保存，持续了49分钟。植入和再灌注后，心脏功能良好，心率为40次/分钟，需要起搏支持至80-90次/分钟，但不需要正性肌力支持。

术后，患者的胸部X光显著改善，胸腔积液排出，肺水肿消退（图2）。术后第1天拔除了气管内插管。围手术期急性肾损伤加剧了他的心肾综合征，需要持续肾脏替代治疗。

图2. 充血性心力衰竭改善。

术后第2天短暂的血流动力学不稳定通过正性肌力支持、液体移除以及将起搏率增加至120次/分钟得到解决。他的基础心律为窦性，心率为70-80次/分钟。作者相信，一段时间内较快的心率是必要的，以平衡较小尺寸心脏的影响。临时心外膜起搏导线出现高阻抗，促使研究团队在术后第3天放置了永久性心外膜导线和起搏器。围手术期肌钙蛋白在术后第2天达到峰值16.50 ng/ml，随后呈下降趋势（图3）。

术后第4天，患者因起搏导线缝合部位突发纵隔出血再次进入手术室，需要大量输血（图1）；相应地重新给予了共刺激阻断。手术后，患者再次拔管，但清除肺部分泌物有困难。术后第7天，患者发生了呼吸心跳骤停。4分钟内重新插管并迅速恢复循环，未留下神经系统后遗症。进行了经皮气管切开术。他逐渐能够长时间使用湿润的气管切开套管，并在协助下站立。

3. 心脏监测
早期常规监测的超声心动图显示射血分数（EF）在55%到65%之间。起搏器维持在115-120次/分钟。整体纵向应变（GLS），作为心脏收缩力的指标，持续在-19或更低（正常值>-15）（图3）。术后第13天进行的右心导管检查测量到心输出量为3.82升/分钟，心指数为1.91升/分钟/平方米，右心房压力为4毫米汞柱，肺毛细血管楔压为7毫米汞柱（图3）。静脉输液放宽后未对血流动力学产生影响。血管扩张持续存在，需要口服和静脉注射血管活性药物支持。

图3. 异种心脏移植排斥反应的检测。

术后第13天进行的心内膜活检（EMB）显示小范围的内皮细胞（EC）激活和显著的毛细血管抗体及补体染色（IgG、IgM、C3d和C4d），但未见EC损伤证据（图4）。血清中供体特异性APA水平未升高，外周免疫细胞表型未提示激活或增殖（图1）。尽管结果存在矛盾，但足以提示抗体介导的排斥反应（AMR）。因此，于术后第14天开始经验性AMR治疗，进行了一次治疗性血浆置换（TPE），重新给予共刺激阻断，并选择了50%白蛋白和50%新鲜冰冻血浆（FFP）作为替代。这些FFP单位中的一些后续检测出抗猪抗体阳性（图1）。由于补体染色持续存在，补体抑制从C1INH改为C5补体阻断（eculizumab，Alexion Pharmaceuticals）。然而，鉴于没有肌钙蛋白升高，供体来源的游离DNA（cfDNA）水平稳定，超声心动图显示的心脏功能在无正性肌力支持下未改变，起搏器下调至110次/分钟，APA水平低，且物理治疗进展持续，AMR的怀疑减轻，未进一步升级AMR治疗。常规临床实验室结果得到了广泛监测。

图4. 抗体介导的排斥反应。

由于炎症性、非感染性腹泻，至术后第16天增加至高达1升/天，患者无法耐受肠内营养。体重下降15公斤，需要完全肠外营养。值得注意的是，患者仍能参与功能强化锻炼，并在术后第23天踩改装的固定自行车。

4. 感染监测

采集前，用于检测潜伏PCMV的血清学（Western blot）和聚合酶链反应（PCR）检测在多个时间点均为阴性。采集后，供体猪组织的检测也为阴性。移植后对受体血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）的PCR检测，以及每周的微生物cfDNA（mcfDNA）检测，均未检测到PCMV；猪淋巴带状疱疹病毒1、2和3；猪圆环病毒；或猪内源性逆转录病毒A/B/C。在不同时间点进行的mcfDNA感染监测显示军团菌、表皮葡萄球菌和胃肠道厌氧菌种的阳性信号。这些病原体均未在培养中生长；然而，患者接受了针对这些病原体的针对性治疗。在粪便和呼吸道PCR中唯一被识别的病毒是术后第30天粪便中的诺罗病毒，其临床意义存疑。

5. 异种移植物失败

术后第29天，患者出现急性血流动力学失代偿，需要液体复苏和增加血管活性药物剂量。由于怀疑败血症，扩大了抗生素治疗范围，但未发现病原体。术后第30天，患者接受了紧急右心导管检查和第二次EMB。右心房和右心室波形显示限制性生理（图3）。排出的血清性心包积液被判定为无血流动力学意义。活检显示毛细血管IgM、IgG和补体（C3d和C4d）沉积增加，内皮细胞广泛激活，局灶性凋亡ECs伴有继发性心肌缺血和收缩带（图4）。

超声心动图显示心脏功能恶化（图3），乳酸升高，混合静脉氧饱和度降至29%，均对正性肌力支持无效。术后第31天，患者被置于体外膜氧合（ECMO）。第二次活检的确认性免疫组化染色提示AMR，于术后第35天，我们给予蛋白酶体抑制剂卡非佐米（27毫克/平方米），以抑制APA产生的潜在浆细胞来源。随后进行了5次计划中的3次每日TPE，使用100%白蛋白替代。给予凝血酶原复合物浓缩液和纤维蛋白原浓缩液以避免进一步输注FFP。在此方案下，尽管同时使用ECMO，未观察到出血并发症。每次TPE后重新给予Tegoprubart和补体抑制（Berinert）。至术后第40天，患者在ECMO上心脏收缩和舒张功能未改善，无法撤机，患者感觉他不太可能实现回家的目标。与家人一起，他选择接受舒缓治疗。

图5. 尸检分析。

尸检的显著发现包括显著增厚的异种移植物（从术前的273克增加到480克）（图5）。组织学上，存在广泛的继发性斑片状心肌细胞缺血坏死的心脏内皮损伤和丧失（图4）。在冠状动脉未受阻且无显著术后肌钙蛋白升高（图3）的情况下，注意到心尖透壁（3.0×2.0×0.6厘米）梗死。散在的瘀点和黏膜糜烂局限于盲肠，组织学显示腺窝脱落和巨噬细胞反应，病因不明。异种移植物的尸检免疫组化（IHC）显示所有六个10-GE人类转基因的分布和相对丰度与阳性对照未移植的10-GE猪心脏相当（图6）。通过Western blot在术前耳廓活检标本、术后每次活检标本和尸检中均确认了转基因表达。

图6. 供体心脏的转基因表达。

讨论

本研究寻找了一位比首例心脏异种移植受者具有更少合并症和更好功能状态的候选者。实验性异种移植的候选者往往存在使他们不适合进行同种移植或长期机械循环支持的合并症。本研究选择的患者能够行走，并作为门诊病人进行管理。尽管在家中进行了积极的医疗管理，但本研究的异种移植团队认为，第二位患者的功能状态恶化到了需要住院管理的程度。在经过调整的医疗优化下，包括实现12升的负液体平衡，他显示出改善的心肾综合征，并且无需机械通气和循环支持。基于对患者优化的多学科评估，本研究团队认为，与首例患者相比，他的骨髓功能得以保留，抗猪抗体（APA）水平低，且供体动物中未检测到猪巨细胞病毒（PCMV），异种心脏移植可能会带来更好的生存结果。

基于首例患者的异种动物源性疾病经验，本研究制定了改进的筛查和监测计划，如方法部分所述。在本例中，未检测到潜伏的PCMV。军团菌、表皮葡萄球菌和胃肠道厌氧菌的阳性微生物cfDNA结果而无相应阳性培养，使生物学解释不明确；然而，每周的监测测试使潜在威胁在达到临床意义之前得到解决。这些结果证明了精心执行的感染监测计划能够实现临床异种移植的原则。

移植后，移植物最初表现良好，无需正性肌力支持，尽管由于长期血管扩张，维持了血管活性药物治疗。由于在将动物从屏障设施中移除时的安全措施，无法进行重复的术前经食管超声心动图（TEE）成像和左心室质量计算；本研究依靠基于非人灵长类动物（NHP）经验的显著体重增加来适当调整异种移植物的大小。本研究之前的患者的10基因编辑（10-GE）猪心脏重328克，来自一位115公斤的男性供体。对于第二位患者，114公斤的供体为女性，心脏重273克。未来需要更多关注10-GE心脏大小的变异性。本研究的获取TEE计算的每搏输出量处于患者可接受范围的下三分之一。尽管进行了最大优化且没有更大的猪可用，作者还是接受了这个心脏，知道这样的移植物会减少错误的余地，但可能会挽救患者的生命。未来，心血管影像团队将指导TEE成像的优化，以准确评估左心室大小.

早期抗体介导的排斥反应（AMR）的检测促使本研究调整了免疫抑制方法和监测。尽管使用C1INH进行了近端补体阻断，但在内皮细胞（ECs）上仍有APA和弥漫性补体沉积的证据，促使本研究转向更远端的C5补体阻断，使用eculizumab。异种移植物中的补体调节蛋白转基因表达与其他10-GE猪相当。然而，确定保护性hDAF和hCD46转基因活性具有挑战性；可能需要进一步的转基因，如hCD59。

在超过2周的时间里，尽管有显著的C3d和C4d沉积，移植物功能仍然良好。这种模糊的临床情况使本研究在最初如何积极地调整AMR治疗方面陷入困境。当第二次活检后本研究获得IHC和转录组学的多模式表型分析时，数据中明显的不一致性得到了澄清，这支持了AMR的诊断。将异种移植物与有无缺血损伤的野生型猪心脏进行比较的基因表达分析显示了一个共同的分子特征，提示AMR。在异种移植物组织中排名靠前的显著上调基因在生物学上与抗体介导的损伤（HLA-A、HLA-DRA、HLA-DPB1、WARS）、自然杀伤（NK）细胞（FCGR3A、FCGR3B）、单核细胞和巨噬细胞激活（CD74、CALHM6、C1QA、C1QB、CD163）、干扰素-γ反应（CXCL9、CXCL10、B2M）以及抗原处理-交叉呈递（CTSS）相关。该分析还显示了插入猪基因组中的人类转基因（CD47、CD46）的上调。如果在第一次活检时获得这些数据，将促使本研究进行更积极的治疗性血浆置换（TPE）治疗。本研究计划使用这种多模式表型技术来检测排斥反应的早期迹象，以便在干预可能更成功时进行治疗.

尽管异种移植物中AMR的发展是明确的，但引发它的因素仍在调查中。目前无法确定不同潜在APA来源的相对影响。罪魁祸首APA可能是自然（预先形成的）、通过血液制品外源性输注的、作为异种反应性免疫反应的一部分诱发的，或者是三者的组合。患者具有低水平的预先形成的APA，并未表现出超急性排斥反应。在术后第13天活检中发现异种移植物上IgG沉积大于IgM，使本研究怀疑自然（预先形成的）或外源性APA发挥了更大的作用。然而，不能排除这反映了诱发的抗体反应的可能性，因为直到术后第8天才达到治疗性Tegoprubart水平。尽管诱导淋巴细胞耗竭在此期间提供了一定程度的保护，但亚治疗性Tegoprubart水平的窗口使得移植物失败可能是由于共刺激阻断的中断。

在诱导免疫抑制后，淋巴细胞群体一直耗竭，直到第35天开始上升。实现治疗性Tegoprubart水平的挑战归因于三个因素。首先，基于之前的NHP实验和制造商进行的药代动力学建模，Tegoprubart的给药在移植前一天开始。其次，术后第4天的输血需求稀释了Tegoprubart的血浆水平。第三，尽管在术后第4天输血和每次TPE后都进行了额外剂量的给药，但这些事件与达到治疗性Tegoprubart水平的延迟相关。未来管理AMR的策略需要考虑这种潜在的并发症。最后，被动APA输注仍是一个强有力的可能；从第一例病例中吸取教训，未给予静脉免疫球蛋白，且在权衡潜在APA给药的风险-收益后才订购每种血液制品.

移植物失败的几个特征表明了异种移植领域进步的途径。在最初AMR的组织学迹象出现两周后，异种移植物失败的出现开始于限制性病理和血流动力学损害，随后收缩力下降。这与心肌显著增厚和心室质量加倍相吻合。组织学上，这表现为内皮细胞激活和随后损伤的进展，而无血管内巨噬细胞或显著的T细胞浸润。随后在尸检中发现了进一步的AMR证据：毛细血管损伤和脱落，伴有继发性局灶性心肌缺血，在巨噬细胞反应的背景下，间质水肿、纤维蛋白沉积、红细胞外渗和反应性肌成纤维细胞。在活检时间点之间，内皮细胞免疫球蛋白和补体染色增加。电子显微镜下显示了进展的EC损伤，初次活检显示EC肿胀，到第二次活检时出现起泡。这在尸检时进展为内皮细胞裸露。这些发现也与同种移植中的AMR相一致。与本研究的NHP系列和首例患者不同，肌钙蛋白并未预测移植物丢失；这目前正在调查中.

其他因素可能在较小程度上促成了患者的死亡。小的心尖梗死的血流动力学意义不明确，难以准确定时，但鉴于炎症环境，它可能至少有1周的历史。梗死可能发生在术后第0天到死亡前一周的任何时间，并在心电图、超声心动图和肌钙蛋白水平上不同程度地反映出来。由于凝血病是异种移植和之前抗CD40L抗体迭代的潜在并发症，基于NHP经验，患者在临床上能够的情况下一直接受肝素抗凝治疗，特别是鉴于通过持续肾脏替代治疗回路持续凝血表现的高凝状态。在他的病程中，患者显示出临床和功能改善，但他开始受到严重腹泻和对多种医疗管理策略抵抗的肌肉减少症的限制。腹泻在标准粪便研究中呈炎症性；推测为对免疫抑制的肠道反应，但在最终组织学上未观察到细胞增多或药物毒性迹象。局限于盲肠的糜烂并不能解释抵抗性腹泻。尽管开始肠外营养，在同一时间框架内，患者开始表现出肌肉减少症，其中骨盆带明显比上身弱。从已知的门诊干体重75公斤增加到82公斤开始，到他去世时体重为67公斤.

总之，作者一直在推进临床心脏异种移植，并继续从每个病例中学习。通过改进筛查，本研究避免了第二位患者暴露于PCMV，这使首例患者的诊断变得复杂。最终，两位患者都显示出类似的移植物失败模式和AMR的证据，在组织学上表现为免疫球蛋白和补体沉积，在第二位患者中较早识别出来。一旦移植物失败在临床上明显，尽管进行了积极的AMR治疗，但无法逆转。本研究在患者病程早期实现治疗性Tegoprubart水平时遇到的挑战可能通过更早的移植前药物给药和更高的谷浓度目标来解决。鉴于尽管异种移植物中适当表达了补体调节蛋白转基因，但仍有补体激活的证据，可能需要进一步的转基因，如CD59，以及药物补体阻断，如eculizumab。即使使用最少，血液制品仍然是心脏移植所必需的。作者认为，使用抗体切割酶imlifidase（Hansa Biopharma）治疗、尽可能预筛查血液制品以及使用纯化的凝血因子制剂，如凝血酶原复合物浓缩液和浓缩纤维蛋白原，将提高异种移植患者的输血安全性。本研究已通过两位人类心脏异种移植受者表明，猪cfDNA是排斥反应的敏感早期标志物，这可能通过心内膜活检标本的多模式表型分析来增强，以便在干预可能成功时进行针对性排斥治疗。作者表示有信心，这些解决方案将使更多患者从心脏异种移植中受益。